以下是玻璃化冷冻的标准步骤,以胚胎为例进行说明（卵子和精子步骤类似，但试剂和时间略有不同）：
- 设备和试剂准备：确保所需试剂（平衡液、冷冻液）温度正确（通常为室温或37°C），并准备好冷冻载体（如Cryotop、Cryoloop、Open Pulled Straw等）。
- 胚胎评估：在显微镜下选择发育到合适阶段（如囊胚或早期胚胎）的胚胎，并进行评分。
平衡（Equilibration）
- 将胚胎转移至平衡液（通常含有低浓度如7.5%的乙二醇和/或二甲基亚砜）中。
- 在室温或37°C下孵育5-15分钟，此步骤的目的是让冷冻保护剂逐渐渗透到细胞内，置换出部分水分，同时避免渗透压休克。
玻璃化冷冻（Vitrification）
- 将胚胎从平衡液中取出,迅速转移至玻璃化冷冻液（通常含有更高浓度如15-20%的乙二醇和/或二甲基亚砜，以及蔗糖等渗透性保护剂）。
- 在极短时间内（通常少于1分钟） 完成装载：
- 将胚胎和少量液体（通常少于1微升）放置在冷冻载体的特定位置（如Cryotop的薄膜上）。
- 动作必须迅速、精准，避免液体量过多。
- 快速投入液氮：立即将载有胚胎的载体投入液氮（-196°C） 中，并迅速盖上盖子或转移到液氮储存罐中，整个过程从接触冷冻液到投入液氮应在60-90秒内完成，以确保细胞内外同时形成玻璃态，而非冰晶。
储存
将冷冻载体标记好患者信息,放入液氮储存罐的特定位置进行长期保存。
解冻（Thawing）
- 从液氮中取出载体,在空气中短暂停留（几秒）。
- 将载体迅速放入37°C 的解冻液（通常含有梯度浓度的蔗糖）中，蔗糖用于帮助细胞脱水并防止再结晶。
- 依次将胚胎转移至稀释液（中等浓度蔗糖）和洗涤液（无蔗糖）中，各停留约5-10分钟，以彻底去除冷冻保护剂。
- 最后将胚胎转移至培养液中,在37°C、CO₂培养箱中培养，并评估其形态和发育情况，准备移植。
关键注意事项
- 速度：玻璃化冷冻成功的关键在于“快”，平衡和装载过程需迅速但有序。
- 冷冻保护剂浓度：需要足够高以实现玻璃化，但不应对细胞产生毒性。
- 载体选择：不同载体（如Cryotop、封闭麦管）各有优缺点，开放载体冷冻速率更快，但理论上存在交叉污染风险；封闭载体更安全。
- 解冻同样关键：解冻过程必须缓慢且平稳地去除保护剂，防止渗透压剧烈变化损伤细胞。
与慢速冷冻的区别
玻璃化冷冻与传统的慢速冷冻（程序化降温）有本质区别：
- 慢速冷冻：通过程序降温仪缓慢降温，让细胞逐步脱水，形成少量冰晶。
- 玻璃化冷冻：不形成冰晶，而是通过超高速降温使液体变成固态的“玻璃”，对细胞损伤更小，复苏率更高。
玻璃化冷冻已成为人类胚胎和卵子冷冻的首选标准技术，尤其在囊胚冷冻方面成功率极高。
